《光学工程基础》清华大学（12）- 应用光学（显微系统）
1. 显微镜及其放大率
显微镜：由焦距很短的物镜和目镜组成；这个系统有较大的光学间隔$\Delta$。
物体一般放置在物镜物方焦点的左侧附近，经物镜成像在目镜物方焦点的右侧，这是一个中间像。它像高是$y_1'$。该中间像经目镜成像，在一个较远的地方，成一个放大的虚像，像高为$y_2'$。
显微镜的垂轴放大倍率 $\beta$：
\[\left.\begin{aligned} \beta&=\beta_1\cdot\beta_2\\ \beta_1&=-\frac{x_1'}{f_1'}=-\frac{\Delta}{f_1'}\\ \beta_2&=-\frac{x_1'}{f_1'} \end{aligned}\right\} ~\rightarrow~ \begin{aligned} \beta&=\beta_1\cdot\beta_2\\ &=\frac{x_1'x_2'}{f_1'f_2'}\\ &=\frac{\Delta\cdot x_2'}{f_1'f_2'} \end{aligned}\]因为显微镜的光学间隔$\Delta$较大，而焦距$f$较小，即分母较小分子较大，故而可知显微镜的垂轴放大倍率很大。
显微镜的垂轴放大倍率 $\alpha$：
\[\begin{aligned} \alpha&=\beta^2\\&=(\frac{x_1'x_2'}{f_1'f_2'})^2 \end{aligned}\]显微镜的角放大倍率 $\gamma$：
\[\begin{aligned} \gamma&=\frac{1}{\beta}\\&=\frac{f_1'f_2'}{x_1'x_2'}~~~~(x_1'\approx\Delta) \end{aligned}\]因为垂轴放大倍率是一个非常大的数，而角放大倍率为垂轴放大倍率的倒数，故而显微镜的角放大倍率是一个非常小的数。
显微镜系统的组合焦距：
\[f'=-\frac{f_1'f_2'}{\Delta}~~~~f=\frac{f_1f_2}{\Delta}\]显微镜的组合焦距较小，因为光学间隔$\Delta$较大。
2. 显微镜的视觉放大率
【显微镜的视觉放大倍率】物体经过显微镜成的像位于无穷远处时，像对人眼的张角正切值与物体位于明视距离处（250mm）时物体对人眼的张角的正切值之比。
\[\Gamma=\frac{tg~\omega''}{tg~\omega_{250}}\]
显微镜物镜的垂轴放大率：
\[\beta_1=\frac{y'}{y}=\frac{\frac{y'}{250}}{\frac{y}{250}}=\frac{tg~\omega_{250}'}{tg~\omega_{250}}\]显微镜目镜的视觉放大率：
\[\Gamma_2=\frac{tg~\omega''}{tg~\omega'_{250}}\]由上述三个式子可知：
\[\left.\begin{aligned} \Gamma&=\frac{tg~\omega''}{tg~\omega_{250}}\\ \beta_1&=\frac{tg~\omega_{250}'}{tg~\omega_{250}}\\ \Gamma_2&=\frac{tg~\omega''}{tg~\omega'_{250}} \end{aligned}\right\} ~\rightarrow~ \Gamma=\beta_1\cdot\Gamma_2\]显微镜的视觉放大倍率等于物镜的放大倍率乘以目镜的放大倍率。其实，显微镜的物镜的放大倍率是垂轴放大倍率，而目镜的放大倍率是视觉放大倍率，它们两者理论上来说是不能相乘的，只是因为我们显微镜的视觉放大倍率恰好是等于物镜的垂直放大倍率与目镜的视觉放大倍率相乘。
用焦距等参数来表示显微镜的视觉放大倍率 $\Gamma$：
\[\left.\begin{aligned} \beta_1=-\frac{x_1'}{f_1'}=-\frac{\Delta}{f_1'}\\ \Gamma_2=\frac{250}{f_2'}\\ \Gamma=\beta_1\cdot\Gamma_2 \end{aligned}\right\}~\rightarrow~\Gamma=-\frac{250\cdot\Delta}{f_1'\cdot f_2'}\]【小结】
- 显微镜的视觉放大率与光学间隔成正比，与物镜和目镜的焦距成反比；
- 显微镜的实质等同于一个焦距非常小的放大镜。
- 当显微镜的虚像调焦到明视距离（250mm）时，其视觉放大倍率：
| 此时视觉放大倍率等于垂轴放大倍率。 |
| 望远镜的视觉放大倍率等于望远镜的角放大倍率； 显微镜的视觉放大倍率等于显微镜的垂轴放大倍率。 |
3. 显微镜的孔径光阑
显微镜一般以物镜框为孔径光阑，测量用的显微镜一般把孔径光阑设置在物镜像方焦面上，形成物方远心光路。
如果把孔径光阑放在物镜的像方焦点处，无穷远的物方入瞳经过显微镜成像在显微镜的像方焦点处，物方入瞳与显微镜像方焦点是共轭点。实际情况中，我们设置的孔径光阑，一般都在显微镜物镜的像方焦点的附近。
无论哪种形式，显微镜的出瞳都在显微镜像方焦平面的附近，离显微镜目镜的像方焦平面也很近。
【放大倍率和数值孔径与出瞳直径的关系】
$A'B'$为物体通过显微镜成的像，大小为$y'$，$U'$为像方孔径角：
\[a'=x'\cdot tan~U'~~~\Rightarrow~~~a'=x'\cdot sin~U'\]像差理论要求，显微镜满足正弦条件：
\[\begin{matrix} y'n'~sin~U'=yn~sin~U&n'~sin~U'=\frac{y}{y'}n~sin~U\\ \end{matrix}\]我们由前面已学知识可知
\[\frac{y}{y'}=\frac{1}{\beta}=-\frac{f'}{x'}\]$n'=1$时（像空间折射率为1）
\[sinU'=-\frac{f'}{x'}nsinU\\ a'=-f'nsinU=-f'NA\]而系统放大率$\Gamma$:
\[\Gamma=\frac{250}{f'}\]故而
\[\left.\begin{aligned} a'&=-f'NA\\ \Gamma&=\frac{250}{f'} \end{aligned}\right\}~\rightarrow~a'=250\cdot\frac{NA}{\Gamma}\]由式子 $a'=250\cdot\frac{NA}{\Gamma}$ 可知，如果显微镜的数值孔径越大，出瞳的直径越大；如果显微镜的放大倍率越大，出瞳的直径就会越小。也就是说，我们平时用高倍显微镜观测物体时，会觉得出瞳直径会变小的原因。
4. 显微镜的机械筒长
【机械筒长】把显微镜目镜和物镜去掉后剩下的镜筒长度，即物镜支撑面到目镜支撑面间的距离 $t_m$。
为了调换方便，和满足互换要求，同时限制显微镜的空间尺寸，机械筒长通常是标准化的，国际上有三种标准：160mm，170mm，190mm三种标准，我国采用160mm的标准。
显微镜工作时，我们更换物镜，并不会影响我们的观察。如何保证呢？->【齐焦条件】。
- 物镜共轭距195mm在设计时保证；
- 物镜框的结构保证物体经显微物镜所成的实像在经筒内的固定平面；
- 显微镜的结构保证目镜的前焦面始终与物镜的像面重合。
【齐焦距离】目镜的安装面与物镜的像面有固定的位置关系，国际上规定该距离$t_0=10mm$，该距离称为齐焦距离。
显微镜的另一种结构：筒长无限的显微光学系统。结构：前置物镜、辅助物镜。
前置物镜把物成像在无限远处，辅助物镜把无限远的像成像在焦平面上，两者间的光路为平行光，所以两者的间隔可以任意改变。辅助物镜焦距200或250mm。更换前置物镜能改变物镜的焦距和放大倍率。
5. 显微镜的分辨率及有效放大率
物镜的线分辨率：
\[\sigma=1.22\frac{\lambda f}{D}\]其中$\lambda$为工作波长，$f$是物镜的焦距，$D$是光学系统的入瞳直径。
显微镜工作室，物体在物镜焦点附近，故而可认为$\frac{D}{2f}\approx sinU$。将其代入得，
\[\sigma=\frac{1.22\lambda}{2nsinU}=\frac{0.61\lambda}{NA}(物体为自然发光点)\]对于不发光的物体，则
\[\sigma=\frac{\lambda}{NA}(垂直入射)\\ \sigma=\frac{0.5\lambda}{NA}(倾斜入射)\]显微镜的分辨率
- 显微镜的数值孔径决定分辨率，数值孔径越大，分辨率越高。
- 通过物体和物镜之间浸液的方式提高数值孔径，进而提高分辨率。液体折射率一般为1.5.这类物镜称为阿贝浸液物镜。
显微镜的有效放大倍率：
分辨率标准：
- 瑞利准则。物镜具有足够的分辨率。
- 放大的像对人眼张角大于人眼分辨率。系统有足够的放大倍率。
- 人眼便于分辨的角距离为2'~4'，该角距在明视距离上的分辨距离$\sigma'$为：$250\times2\times0.00029<\sigma'<250\times4\times0.00029$；
- 显微镜仪器分辨率：$\sigma=\frac{0.5\lambda}{NA}$；
-
若显微镜分辨率$\sigma$乘以显微镜的总放大率$\Gamma$等于人眼的分辨率，则：$250\times2\times0.00029<\frac{0.5\lambda}{NA}\cdot\Gamma<250\times4\times0.00029$。
- 符合上式的放大率称为显微镜的有效放大倍率，
- 显微镜的有效放大倍率取决于物镜的数值孔径。（同增减）
- 放大率小于有效放大率的下限时，即使物镜已经把物体细节分辨出来，也会因放大率不够，不能被人眼分辨。
- 放大倍率大于有效放大率的上限时，是无效放大率，不能使被观察物体的细节更清晰。
6. 显微镜的景深
【显微镜的景深】人眼通过显微镜调焦到某一个平面（我们称之为对准面）上，对准面前和对准面后一定范围内的物体都能清晰成像。能清晰成像的远近物面之间的距离，我们称之为显微镜的景深。
- 显微镜的出瞳一般与其像方焦点$F'$重合；
- $A'B'$是显微镜对准平面的像平面，称为景像面的像平面；$A_1'B_1'$是对准平面前的某一平面的像平面；
- $z'$对显微镜出瞳中心的张角要小于眼睛的极限分辨角。
$2dx'$为显微镜能清晰成像的深度。
\[2dx'=\frac{x'z'}{a'}=\frac{x'\cdot(x'\epsilon)}{a'}=\frac{x'^2\epsilon}{a'}\]上面式子是显微镜的像空间可以清晰成像的一个范围。而物空间中与之对应的$2dx$即为景深：
\[2dx=\frac{2dx'}{\alpha}\]其中$\alpha$为轴向放大倍率
\[\begin{aligned} \alpha&=\frac{dx'}{dx}=-\beta^2\frac{f'}{f}=-\frac{x'^2}{f'^2}\frac{f'}{f}\\ &=-\frac{x'^2}{ff'}=\frac{n'x'^2}{nf'^2}=\frac{x'^2}{nf'^2} \end{aligned}\]再利用视觉放大倍率和数值孔径与出瞳直径的关系：$a'=250\cdot\frac{NA}{\Gamma}$；以及视觉放大倍率和焦距的关系：$\Gamma=\frac{250}{f'}$，我们可以得到
\[\begin{aligned} 2dx&=\frac{2dx'}{\alpha}=\frac{\frac{x'^2\epsilon}{a'}}{\frac{x'^2}{nf'^2}}=\frac{nf'^2\epsilon}{a'}\\ &=\frac{nf'^2\epsilon}{250\cdot\frac{NA}{\Gamma}}=\frac{nf'^2\epsilon}{250\cdot\frac{NA}{\frac{250}{f'}}}=\frac{nf'\epsilon}{NA}\\ &=\frac{nf'\epsilon}{NA}=\frac{n(\frac{250}{\Gamma})\epsilon}{NA}=\frac{250\cdot n\cdot\epsilon}{\Gamma\cdot NA}\\ \end{aligned}\]显微镜物空间折射率 $n$；人眼的角分辨率 $\epsilon$；显微镜的视觉放倍率 $\Gamma$；数值孔径 $NA$。
- 显微镜的数值孔径越大，放大倍率越大，其景深越小。
- 提高显微镜物方空间的折射率，也能提高它的景深的大小。
7. 显微镜系统的照明
显微镜可以分为两部分：成像系统和照明系统。
照明要求：
- 足够亮度；
- 足够均匀性。
两种照明光路：
- 透射式；
- 反射式。
两种照明方式：
- 明场照明；
- 暗场照明。
暗场照明的优点：提高图像对比度和分辨率。
大部分的显微镜的照明方式采用了透射式的明场照明。透射式的明场照明主要有两类：临界照明，科勒照明。
【临界照明】
瞳对瞳，视场对视场。（聚光灯的出瞳与物镜的入瞳重合，聚光系统的视场与物镜的视场重合。）
特点：
- 聚光灯的光源像与被观测物体的物平面重合；
- 聚光灯的像方孔径角比显微镜物方孔径角相同或略大；
- 照明聚光系统的孔径光阑常设在聚光灯的物方焦平面上，如果显微物镜为远心物镜，那么聚光系统的出瞳与物镜的入瞳重合。
缺点：
- 物面上有灯丝像；
- 均匀性较差
【科勒照明】
视场对瞳，瞳对视场。聚光系统的出瞳与显微物镜的镜面重合；聚光系统的像方视场与显微物镜的入瞳重合。
保证了照明系统的能量全部进入后续显微物镜。
特点：
- 聚光镜的光源经聚光系统的前组成像在视场光阑上；
- 聚光镜的像方孔径光阑紧贴聚光镜前组，经聚光镜后组成的像（即照明系统的出瞳）与标本面重合；照明系统孔径光阑起到限制显微物镜视场的作用；
- 聚光镜的孔径光阑处光强较均匀，因此在标本面上得到均匀的照明；
- 聚光系统的视场光阑位于聚光系统后组的物方焦点上，视场光阑经后组成像在像方无限远处（与远心显微物镜的入瞳重合）。